1. 蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)的創(chuàng)新－新型色譜介質(zhì)的合成

1.1 雙孔與超大孔色譜介質(zhì)

色譜介質(zhì)是蛋白質(zhì)色譜的核心構(gòu)件。目前商業(yè)化蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)的孔道尺寸多在100 nm以下，孔道對蛋白質(zhì)分子的（擴散）傳質(zhì)存在嚴(yán)重地阻滯作用，導(dǎo)致色譜柱效、處理能力（動態(tài)吸附容量）和分離度的顯著降低。上世紀(jì)80年代后，若干研究相繼報道了利用孔內(nèi)對流傳質(zhì)改善色譜介質(zhì)孔內(nèi)傳質(zhì)的實驗結(jié)果。基于這一思路，1990年前后Afeyan等人合成了聚苯乙烯-二乙烯基苯POROS^®介質(zhì)^[1]。POROS^®介質(zhì)同時具有600－800nm的對流孔以及連接這些對流孔、孔徑在50－150nm的擴散孔。POROS^®介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)分子通過對流傳質(zhì)而迅速到達(dá)色譜配基附近；而連接對流孔間的擴散孔在縮短擴散距離（<1 μm）的同時也提供了較大的比表面積，從而確保了色譜介質(zhì)的高吸附容量。受此啟發(fā)，一系列基于不同材料和合成方法的大孔、超大孔蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)相繼問世。天津大學(xué)孫彥等人分別以碳酸鈣顆粒和水為致孔劑合成了具備超大孔結(jié)構(gòu)的瓊脂糖、纖維素以及聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（GMA）-甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）等色譜介質(zhì)^[3]。蛋白質(zhì)分子在超大孔瓊脂糖離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)的有效擴散系數(shù)為傳統(tǒng)瓊脂糖色譜介質(zhì)的2倍以上，動態(tài)吸附容量提高了50%并且在300－1800 cm/h的線性速度范圍內(nèi)柱效基本恒定^[4]。

1.2 微濾膜和整體柱

另一種引入微米級孔道結(jié)構(gòu)的方法是以微濾膜為色譜介質(zhì)。這種以微濾膜為色譜介質(zhì)的色譜分離方法稱為膜色譜。微濾膜的孔徑通常在0.22μm以上，在跨膜壓差作用下料液中的蛋白質(zhì)分子以主體流動的方式流經(jīng)微濾膜，接近膜孔表面的色譜配基。因此，膜色譜可以實現(xiàn)高流速下目標(biāo)蛋白質(zhì)的快速分離。由于微濾膜內(nèi)無擴散孔且膜厚度有限（100-200 μm），膜色譜的處理能力和柱效通常很低，因此更多地應(yīng)用于親和色譜中。

整體柱技術(shù)是解決上述瓶頸的有效方法。整體柱的色譜介質(zhì)是在色譜柱內(nèi)通過原位聚合方法合成的柱狀多孔固定相，其可看作是若干疊加的微濾膜。與超大孔色譜介質(zhì)粒子類似，整體柱內(nèi)同時具備微米級的對流孔和納米級的擴散孔^[5]。與膜色譜相比，整體柱內(nèi)擴散孔提供了更大的吸附面積，解決了膜色譜處理能力低的問題。與填充超大孔粒子的常規(guī)固定床色譜相比，整體柱的制備方法更便捷、重現(xiàn)性更好；整體柱的空隙率幾可忽略不計（填充床色譜柱通常在0.3-0.5之間），處理能力得以顯著提升；流經(jīng)整體柱的流動相均以主體流動方式穿過對流孔，傳質(zhì)速率更快。

在此基礎(chǔ)上，孫彥等人構(gòu)想了一個整體柱色譜的理想結(jié)構(gòu)模型，如圖1所示^[3]。整體柱的對流孔由內(nèi)徑1－5μm、緊密排布且平行于色譜柱軸向的六角直管構(gòu)成；六角直管管壁的多孔骨架（圖1中灰色部分）則形成整體柱的擴散孔，其厚度為1－5μm。色譜過程中，流動相可徑直流經(jīng)色譜柱，有效地降低了流動相的流動阻力。構(gòu)成擴散孔的多孔骨架一方面縮短了蛋白質(zhì)分子孔內(nèi)擴散距離，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子與吸附位點的快速結(jié)合；另一方面，多孔骨架提供了更大的吸附面積，提高了吸附容量。因此，整體柱在滿足流動相高傳質(zhì)速率的同時，確保了蛋白的高吸附容量。但該方法的實現(xiàn)還需要在材料、合成工藝方面的進(jìn)一步創(chuàng)新。

 

圖1 理想色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)示意圖^[3]

1.3 葡聚糖接枝離子交換色譜介質(zhì)

近來，一種以Sepharose XL系列介質(zhì)為代表的離子交換色譜介質(zhì)引起了廣泛關(guān)注。這類介質(zhì)是通過將葡聚糖接枝于常規(guī)色譜介質(zhì)的孔道表面，進(jìn)而偶聯(lián)離子交換配基的方法得到的。Stone等人的研究表明，接枝分子量為40kDa葡聚糖的Sepharose 6B色譜介質(zhì)的孔徑由19.4 nm降低到6.1 nm；但在葡聚糖接枝的離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)，溶菌酶的有效擴散系數(shù)卻可達(dá)其在自由溶液中的5-10倍^[6]；同時，蛋白質(zhì)的飽和吸附量也有明顯提高^[7]。

蛋白質(zhì)色譜的處理能力不僅取決于傳質(zhì)速率也與介質(zhì)的飽和吸附量有關(guān)。受限于蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度，蛋白質(zhì)在色譜介質(zhì)上的吸附容量往往低于500 mg/mL^[8]。在有限的吸附容量條件下，選擇性吸附目標(biāo)蛋白成為今后蛋白質(zhì)色譜發(fā)展的一個重要方向。這方面的研究工作已經(jīng)有了一些非常有益的嘗試^[3]。

2. 蛋白質(zhì)色譜的過程集成－膨脹床色譜

2.1 膨脹床色譜的方法和優(yōu)勢

細(xì)胞培養(yǎng)的粗料液中不僅含有目標(biāo)蛋白還包括大量共存的可溶性（如雜蛋白、核酸等）及不可溶性雜質(zhì)（如細(xì)胞碎片等），因此需要引入額外的單元操作來處理共存的雜質(zhì)。這勢必導(dǎo)致目標(biāo)蛋白收率的降低。在生物分離過程中，多個單元操作的過程集成是解決這一問題的有效途徑之一。

膨脹床色譜就是這樣的一種將細(xì)胞（碎片）分離、蛋白吸附和目標(biāo)蛋白回收等步驟集成的色譜分離技術(shù)。膨脹床色譜柱的頂部和底部分別安裝有可調(diào)節(jié)高度的高度調(diào)節(jié)器和可自由通過細(xì)胞碎片的流體分布器。色譜柱內(nèi)填充的具有一定粒徑和密度分布的色譜介質(zhì)；當(dāng)流動相自柱底高速流入時，色譜介質(zhì)在流動相的作用下流態(tài)化，沿色譜柱軸向形成穩(wěn)定的粒徑和（或）密度分布，床層的空隙率大為提高（可到0.8以上），粗料液中的細(xì)胞或細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)可自由通過。膨脹床色譜可認(rèn)為是一種穩(wěn)定的流化床模式；與常規(guī)流化床相比，膨脹床色譜中流動相以近平推流的方式流經(jīng)色譜柱，固、液兩相返混程度較低，近似于固定床色譜。因此，膨脹床色譜技術(shù)適用于從含有固形雜質(zhì)的粗料液中回收目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 膨脹床色譜介質(zhì)及分級特性

膨脹床色譜成功的關(guān)鍵在于開發(fā)的色譜介質(zhì)。表1列出了若干商品化膨脹床色譜介質(zhì)的特性參數(shù)。為了適應(yīng)膨脹床色譜高流速操作的需要，理想的膨脹床色譜介質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有較高的密度和較短的介質(zhì)內(nèi)傳質(zhì)路徑，高密度小粒徑色譜介質(zhì)和薄殼型色譜介質(zhì)成為了膨脹床色譜介質(zhì)的發(fā)展方向。孫彥等人先后開發(fā)了多種瓊脂糖包裹高密度惰性材料（如氧化鋯-硅膠、玻璃珠等）的高密度薄殼型膨脹床色譜介質(zhì)^[3]。在相同的操作條件下，瓊脂糖包裹玻璃珠的薄殼型色素親和色譜介質(zhì)的動態(tài)吸附容量可達(dá)商業(yè)化膨脹床色譜介質(zhì)的2倍以上^[9]。

表1 商品化的膨脹床色譜介質(zhì)及主要特性（Spherodex，預(yù)裝柱，瓊脂糖凝膠，美國GE）