細(xì)胞凋亡是指為維持有機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。正常情況下任何細(xì)胞在形成過(guò)程中發(fā)生的異常都會(huì)通過(guò)凋亡消除。例如體內(nèi)的癌細(xì)胞增長(zhǎng)為腫瘤的過(guò)程會(huì)受細(xì)胞凋亡的引導(dǎo)而被抑制。然而在抑癌基因p53出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，凋亡就不會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的不斷增長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡可以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的變化或生物化學(xué)的變化來(lái)檢測(cè)。目前常用的指標(biāo)有caspase活性變化、DNA碎片、磷脂酰絲氨酸的外翻等。AnnexinV染色的細(xì)胞可以用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞膜變化。在細(xì)胞凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜特異性結(jié)合，因此AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。用綠色熒光FITC標(biāo)記的AnnexinV通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可以檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
 

　　凋亡試劑盒的操作流程：
 

　　(Ⅰ)誘導(dǎo)凋亡的操作步驟  1.制備細(xì)胞(Jurkatcell)懸液(1×106cells/ml)2.加入終濃度為1μg/ml的凋亡誘導(dǎo)劑(Staurosuporine)3.在37℃下培養(yǎng)3.5h。*Staurosuporine用于誘導(dǎo)Jurkatcell凋亡。較佳誘導(dǎo)條件請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞類型與誘導(dǎo)劑調(diào)整。
 

　　(Ⅱ)AnnexinV染色操作步驟：
 

　　1.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1,000rpm離心3min，取出上清液。
 

　　2.加入PBS，1,000rpm離心3min，去除上清液。再重復(fù)本步操作一次。
 

　　3.用之前準(zhǔn)備好的1×AnnexinVBindingSolution制備細(xì)胞終濃度為1×106cells/ml的細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖孕姓{(diào)整，一般推薦不少于500μl細(xì)胞懸液。
 

　　4.取100μl步驟3中制備的細(xì)胞懸液，加入到一個(gè)新的tube中。
 

　　5.向細(xì)胞懸液中加入5μlAnnexinV,FITC結(jié)合物，再加入5μlPISolution。
 

　　6.室溫下避光培養(yǎng)15min。
 

　　7.加入400μl1×AnnexinVBindingSolution，請(qǐng)?jiān)谠?小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。