一、實驗原理

    細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)， 即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。

    細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMS作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。

    二、實驗方法

    材料：

    小鼠，生理鹽水，100ml滅菌燒杯，15ml離心管，培養(yǎng)皿，滴管，無菌鑷子、剪刀，篩網(wǎng)，泡沫板，大頭針，酒精燈，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng) 液，PBS，0.25%胰酶，超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡，顯微鏡，計數(shù)板，離心機，恒溫水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，凍存管，凍存液，廢液缸等。

    方法：

    （1）原代培養(yǎng)：

    1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺內(nèi)，固定在泡沫板上。

    2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個橫切口，將皮膚向上撕開，然后剪開肌肉等，暴露出腹腔，在左側(cè)找到脾臟，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中。

    3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次，并剔除多余無用的組織。

    4.將篩網(wǎng)置于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)上，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨，同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。

    5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中，離心（1000rpm,5min），吸去上清（去除血液等）。

    6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻，取樣計數(shù)。

    7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上。

    面做好標(biāo)志，注明細(xì)胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    （2）傳代培養(yǎng)：

    1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代。

    2.培養(yǎng)液瓶打開后，過酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍。

    3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭，過火，放入培養(yǎng)液瓶中。

    4.打開培養(yǎng)瓶，瓶口過火，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。

    5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶，用量以薄薄蓋滿一層為宜，37℃消化，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基。

    6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于C2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回C2培養(yǎng)箱。

    7.對半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。