如何選擇熒光二抗
 

如何選擇二抗——根據(jù)一抗種屬及類型選擇合適的二抗

二抗廣義上是指專門(mén)和一抗進(jìn)行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體，在免疫學(xué)反應(yīng)中，經(jīng)常需要針對(duì)試驗(yàn)選擇不同的二抗，檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測(cè)方案，因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測(cè)方案的要求，一般來(lái)說(shuō)，選擇合適的二抗需要從下面幾個(gè)方面考慮：

【一抗的種屬來(lái)源】

二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來(lái)源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。抗不同種屬的*二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、人、豚鼠、豬、馬、牛、雞、鴨等二抗。

【一抗的類別亞型】

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中都會(huì)有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門(mén)針對(duì)這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG。通用的IgG（H+L）二抗，或者特異性只結(jié)合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。

【二抗的種屬來(lái)源】

一般來(lái)說(shuō)，不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的，來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒(méi)有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里， 如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的，一個(gè)是小鼠來(lái)源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。

【二抗的耦聯(lián)標(biāo)記】

一般來(lái)講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于Western Blot和ELISA，zui常用的二抗是酶標(biāo)二抗；而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用Biotin/Avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。

【是否經(jīng)過(guò)血清吸附過(guò)的二抗】

為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合，需提供不同血清吸附的*二抗。如您的檢測(cè)樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果您對(duì)實(shí)驗(yàn)的特異性要求很高，那我們向您推薦經(jīng)過(guò)人血清吸附過(guò)的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過(guò)人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發(fā)生非特異性反應(yīng)的IgG，因此將非特異性結(jié)合降低到zui低。

【Anti-IgG還是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】

在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時(shí)候選擇二抗時(shí)選擇Anti-IgG, F（ab’）2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG （H+L）二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng)，即與IgG的Fc的F（ab’）2片段都能結(jié)合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應(yīng)。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment經(jīng)過(guò)了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F（ab’）2片段結(jié)合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此與它們也有交叉反應(yīng)。

【Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG （gamma）、Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha）】

在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，只需要檢測(cè)樣本里的IgG或者IgM，常規(guī)的Anti-IgG （H+L）由于與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng)，而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此不能特異性的檢測(cè)某種類型的IgG或者IgM。這時(shí)候就需要針對(duì)特殊類型Ig分子的二抗。按照標(biāo)記分，有HRP、AP、生物素等標(biāo)記二抗，F(xiàn)ITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等熒光二抗；按照檢測(cè)物種分，有抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉(cāng)鼠、狗、牛，以及多種細(xì)菌類二抗；另外，還有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2等不同類型抗體。